Thực hiện định danh vi khuẩn trong phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn để chẩn đoán bệnh gan thận mủ ở cá basa như thế nào?

Nội dung chính

• Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp nuôi cấy phân lập định danh vi khuẩn để chẩn đoán bệnh gan thận mủ ở cá basa gồm những thiết bị dụng cụ nào?
• Xác định đăng tính sinh hóa trong phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn dựa theo những chỉ tiêu nào?
• Thực hiện định danh vi khuẩn trong phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn để chẩn đoán bệnh gan thận mủ ở cá basa như thế nào?

Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp nuôi cấy phân lập định danh vi khuẩn để chẩn đoán bệnh gan thận mủ ở cá basa gồm những thiết bị dụng cụ nào?

Bệnh gan thận mủ ở cá basa (Hình từ Internet)

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-16:2016 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn quy định về thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn như sau:

Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng cho phương pháp nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn

4.1.1 Nồi hấp vô trùng, duy trì nhiệt độ 115°C và 121°C.

4.1.2 Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 28°C đến 37°C.

4.1.3 Kính hiển vi quang học, vật kính 10 X, 20 X, 40 X và 100 X.

4.1.4 Ống nghiệm vô trùng, dung tích 15 ml.

4.1.5 Đèn cồn.

4.1.6 Que cấy.

4.1.7 Phiến kính, vô trùng.

4.1.8 Lamen, vô trùng.

4.1.9 Dao mổ, panh, kéo vô trùng.

4.2 Thiết bị, dụng cụ sử dụng cho phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và Real-time PCR

4.2.1 Máy nhân gen (PCR)

4.2.2 Máy Real-time PCR

4.2.3 Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

4.2.4 Máy lắc trộn vortex.

4.2.5 Máy spindown.

4.2.6 Bể ủ nhiệt, duy trì nhiệt độ từ 55°C đến 60°C.

4.2.7 Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.

4.2.8 Máy đọc gel.

Theo đó, thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn gồm:

- Thiết bị, dụng cụ sử dụng cho phương pháp nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn

- Nồi hấp vô trùng, duy trì nhiệt độ 115°C và 121°C.

- Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 28°C đến 37°C.

- Kính hiển vi quang học, vật kính 10 X, 20 X, 40 X và 100 X.

- Ống nghiệm vô trùng, dung tích 15 ml.

- Đèn cồn.

- Que cấy.

- Phiến kính, vô trùng.

- Lamen, vô trùng.

- Dao mổ, panh, kéo vô trùng.

Xác định đăng tính sinh hóa trong phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn dựa theo những chỉ tiêu nào?

Theo tiết 6.1.3.2.2 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-16:2016 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn quy định về xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn gây nên bệnh gan thận mủ ở cá basa như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Giám định Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn

...

6.1.3 Cách tiến hành

...

6.1.3.2.2 Xác định các đặc tính sinh hóa

Xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản: vi khuẩn di động, gram âm, âm tính với oxidase, dương tính với catalase, O/F dương tính và các chỉ tiêu sinh hóa nêu trong bảng 1.

- Xác định các chỉ tiêu di động, oxidase, catalase và phản ứng O/F của vi khuẩn (xem Phụ lục B).

- Tiến hành các phản ứng sinh hóa.

VÍ DỤ: Sử dụng bộ kít API 20E (xem Phụ lục C), kết quả được đọc bằng phần mềm đọc kết quả API 20E

Theo đó, khi áp dụng phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn thì việc xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn gây nên bệnh gan thận mủ ở cá basa được dựa theo các chỉ tiêu sinh hóa theo bảng 1 Tiêu chuẩn nêu trên.

Thực hiện định danh vi khuẩn trong phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn để chẩn đoán bệnh gan thận mủ ở cá basa như thế nào?

Theo Phục lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-16:2016 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn quy định về cách định danh vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ ở cá basa như sau:

Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20 E

C.1 Thuốc thử và vật liệu thử

C.1.1 Bộ kít API 20 E.

C.1.2 Nước muối sinh lý.

C.1.3 Nước cất tiệt trùng.

C.1.4 Parafin, đã tiệt trùng.

C.3 Cách tiến hành

Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý (C.1.2), lắc trộn đều.

Cho một ít nước cất tiệt trùng (C.1.3) vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm khi ủ trong tủ ấm (4.1.2).

Dùng pipet với đầu týp tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của bộ kít. Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô CIT, VP, GEL thì nhỏ đầy, 5 ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE cho thêm parafin tiệt trùng (C.1.4) để tạo điều kiện yếm khí.

Đậy nắp khay lại và ủ trong tủ ấm (4.1.2) ở 28°C.

Đọc kết quả sau 18 h đến 24 h.

C.3 Đọc kết quả

a) Kiểm tra và ghi nhận tất cả các chỉ tiêu không cần cho thêm thuốc thử, đọc kết quả dựa vào bảng C.1.

b) Đối với các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử:

+ TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Màu đen xuất hiện thì kết quả là phản ứng dương tính, màu vàng thì kết quả phản ứng âm tính;

+ IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND. Đợi 2 min. Một vòng màu đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính, màu vàng là âm tính;

+ VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP1, VP2. Đợi ít nhất 10 min, màu hồng hoặc đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính. Nếu màu hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10 min đến 12 min là phản ứng âm tính.

Theo đó để định danh được vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cần chuẩn bị Bộ kít API 20 E; nước muối sinh lý; nước cất tiệt trùng; Parafin, đã tiệt trùng.

Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý, lắc trộn đều.Cho một ít nước cất tiệt trùng vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm khi ủ trong tủ ấm.

Dùng pipet với đầu týp tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của bộ kít. Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô CIT, VP, GEL thì nhỏ đầy, 5 ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE cho thêm parafin tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí.

Cuối cùng là đậy nắp khay lại và ủ trong tủ ấm ở 28°C và đọc kết quả sau 18 h đến 24 h. Kết quá định danh vi khuẩn gây nên bệnh gan thận mủ ở cá sẽ dựa theo bảng C1 tiêu chuẩn nêu trên.

Đối với các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử ta thực hiện như sau:

- TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Màu đen xuất hiện thì kết quả là phản ứng dương tính, màu vàng thì kết quả phản ứng âm tính;

- IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND. Đợi 2 min. Một vòng màu đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính, màu vàng là âm tính;

- VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP1, VP2. Đợi ít nhất 10 min, màu hồng hoặc đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính. Nếu màu hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10 min đến 12 min là phản ứng âm tính.