Thể tích các thành phần sử dụng phản ứng Realtime PCR để thực hiện chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm bằng phương pháp Realtime PCR là bao nhiêu?

Nội dung chính

• Các thiết bị dụng cụ nào cần có khi thực hiện phương pháp Realtime PCR?
• Thực hiện phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm như thế nào?
• Thể tích các thành phần sử dụng phản ứng Realtime PCR để thực hiện chẩn đoán bằng phương pháp Realtime PCR là bao nhiêu?

Các thiết bị dụng cụ nào cần có khi thực hiện phương pháp Realtime PCR?

Theo Mục 4 TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về thiết bị dụng cụ dùng khi thực hiện phương pháp Realtime PCR như sau:

"4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR, Realtime PCR

4.1.1 Máy nhân gen PCR.

4.1.2 Máy Realtime PCR.

4.1.3 Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

4.1.4 Máy lắc trộn vortex.

4.1.5 Máy ly tâm nhanh spindown.

4.1.6 Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.

4.1.7 Máy đọc gel."

Như vậy, khi bạn muốn thực hiện phương pháp Realtime PCR thì cần phải có những dụng cụ, thiết bị nêu trên.

Thể tích các thành phần sử dụng phản ứng Realtime PCR để thực hiện chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm bằng phương pháp Realtime PCR là bao nhiêu? (Hình từ Internet)

Thực hiện phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm như thế nào?

Theo tiểu mục 6.2 Mục 6 TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về việc chẩn đoán bệnh đốm trắng bằng phương pháp Realtime PCR với tôm sú giống như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phương pháp Realtime PCR

6.2.1 Lấy mẫu (Theo 6.1.1)

6.2.2 Bảo quản mẫu (Theo 6.1.2)

6.2.3 Chuẩn bị mẫu (Theo 6.1.3)

6.2.4 Cách tiến hành

6.2.4.1 Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ADN: DNeasy®Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506)[4]) (xem phụ lục B).

6.2.4.2 Chuẩn bị mồi

Phương pháp Realtime PCR sử dụng cặp mồi WSSV1011F /WSSV1079R và đoạn dò WSSV-p (3.2.2) để phát hiện vi rút đốm trắng. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục D, Bảng D.1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.9) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).

- Đoạn dò WSSV-p sử dụng nồng độ 6 µM: pha loãng đoạn dò bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (3 µl mồi gốc và 47 µl nước tinh khiết không có nuclease)

6.2.4.3 Tiến hành phản ứng realtime PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy Realtime PCR (4.1.2) theo phương pháp Realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút WSSV sử dụng cặp mồi đặc hiệu WSSV1011F /WSSV1079R và đoạn dò WSSV-p (3.2.2), sử dụng kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục D).

6.2.4.4 Đọc kết quả

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct).

- Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct = ± 2

Với điều kiện phản ứng như trên:

- Mẫu có giá trị Ct < 35 được xem là dương tính

- Mẫu không có giá trị Ct là âm tính

- Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ.

CHÚ Ý: - Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

- Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

7 Kết luận

Mẫu tôm được xác định mắc bệnh đốm trắng khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh đốm trắng và:

- Có kết quả dương tính với WSSV bằng phương pháp Nested PCR, hoặc:

- Có kết quả dương tính với WSSV bằng phương pháp Realtime

Theo đó, để thực hiện việc chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm bằng phương pháp Realtime PCR cần thực hiện theo từng bước được nêu tại tiểu mục 6.2 Mục 6 TCVN 8710-3:2019 như trên.

Thể tích các thành phần sử dụng phản ứng Realtime PCR để thực hiện chẩn đoán bằng phương pháp Realtime PCR là bao nhiêu?

Theo Mục D.2 Phục lục D TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về thể tích các thành phần khi thực hiện phản ứng Realtime PCR như sau:

D.2 Thực hiện phản ứng Realtime PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi đặc hiệu WSSV1011F /WSSV1079R và đoạn dò WSSV-p (3.2.2), sử dụng kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen của Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG, Cat.No: 11730-017[7]).

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng D.2).

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng WSSV chuẩn.

Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 5 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.2) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng D.3).

CHÚ THÍCH BẢNG: (*) Nhiệt độ và thời gian này phù hợp với máy Realtime PCR ABI 7500

Như vậy, khi thực hiện phản ứng Realtime PCR cần chuẩn bị các thành phần đúng với số thể tích được quy định tại bảng D2 tại Mục D.1 Phục lục D TCVN 8710-3:2019 nêu trên.